南宋时期才貌端丽的杜丽娘与柳梦梅在梦中相会相爱，醒后寻梦不得抑郁而终。过了三年，柳梦梅在梅花庵观偶然发现杜丽娘画像惊奇梦中佳人确有其人，杜丽娘的魂魄也现身并叫柳梦梅掘坟开棺，她的魂魄归体后死而复生，他们真挚的爱恋突破生死界限，二人终于修成正果。
南安太守杜宝请来陈最良教授女儿杜丽娘读书，读到“窈窕淑女，君子好逑”时，杜丽娘心起波澜，春心萌动间有感而入梦，梦中与书生柳梦梅在牡丹亭邂逅相会，从此愁思难解一病不起。
弥留之际，她请求父亲将她葬在梅树下并嘱咐春香把自己的画像沉在太湖石底。杜宝后来升任淮阳安抚使，委托陈最良葬女并修建“梅花庵观”以祭奠女儿。
三年后，柳梦梅赴京赶考路遇梅花庵便在此借宿，机缘巧合下发现了太湖石底的杜丽娘画像，并且发现画像中人就是自己三年前梦中的佳人。
杜丽娘魂兮归来，与书生柳梦梅在梅花庵再会，他们挖开梅花树下的坟墓，丽娘尸身如常人一般，她缓缓睁眼死而复生，两人破除生死的阻隔终于在一起。
陈最良发现梅花庵中丽娘的坟墓被掘，进京告发柳梦梅盗墓之罪，柳梦梅在临安应试之后受丽娘之托送家信传报死而复生的喜讯却被杜宝囚禁。
此时，朝廷放榜，柳梦梅状元及第，杜宝不得不放了书生，但他拒绝相信女儿已经复活的事实，向上奏请皇帝公断。
皇帝传讯杜丽娘，用照妖镜验明了杜丽娘是真正的还魂复生，父女终于相认，皇帝下旨赐婚柳梦梅和杜丽娘，两人幸福的走向圆满结局。
汤显祖在《牡丹亭》的《题词》中说：“情不知所起，一往而深。生者可以死，死可以生。生而不可与死，死而不可复生者，皆非情之所至也。”
据记载，《牡丹亭》在当时一上演便票房爆火，浓郁的浪漫气息和抒情色彩激发了大家对“情之必有”的人伦情感的渴盼，杭州女子冯小青写下诗句，“冷雨幽帘不可听，挑灯闲看《牡丹亭》，人间亦有痴如我，岂独伤心是小青”。
明代戏曲理论批评家沈德符评价：“《牡丹亭梦》一出，家传户诵，几令《西厢》减价。”
年5月，《牡丹亭》的西方歌剧版本在维也纳首演，而后又相继在罗马、伦敦、巴黎巡演。
年，联合国教科文组织将中国昆曲列入“世界非物质文化遗产”，其中有《牡丹亭》在世界各地巡演推广昆曲文化的功劳。